显微镜成像原理及分类

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显微镜

光学显微镜（Optical Microscopy）

  • 使用白光、荧光或激光
  • 借助光的折射（refraction）、反射（reflection）、衍射（diffraction）工作

电子显微镜（Electron Microscopy）

  • 使用电磁辐射（electromagnetic radiation）或电子束（electron beams）

  • 借助辐射源的折射（refraction）、反射（reflection）、衍射（diffraction）工作

  • 电子显微镜的分辨率（约0.2nm）远高于光学显微镜的分辨率（约200nm）

  • 样本必须在真空中观察，无法观察活细胞
  • 价格远高于光学显微镜，维护成本较高

扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscopy）

  • 借助物理探针与样本表面相互作用工作

  • 分辨率极高，高于电子显微镜
  • 得到的是实时的、真实的样品表面的高分辨率图像，可以成三维的样品表面图像
  • 使用环境宽松

  • 价格低于电子显微镜

  • 扫描速度受探针限制，效率略低
  • 由于压电效应在保证定位精度前提下运动范围很小（难以突破100μm量级），而机械调节精度又无法与之衔接，故不能做到象电子显微镜的大范围连续变焦，定位和寻找特征结构比较困难

光学显微镜原理

光的性质

  • 折射
  • 反射
  • 数值孔径（Numerical Aperture, NA）

数值孔径

  • 描述物镜收光锥角的大小
  • 是显微镜收光能力的量度，决定了其空间分辨率（NA越高，空间分辨率越高）
  • ，n为工作介质的折射率，θ为光进出透镜时最大锥角的一半

光学显微镜分辨率限制

  • 分辨率与成正比，其中λ为光的波长
  • NA越大分辨率越高
  • 目前最高分辨率2um

光学显微成像

指透过样品或从样品反射回来的可见光，通过一个或多个透镜后，能够得到微小样品的放大图像的技术。

所得图像可以通过目镜直接用眼睛观察，也可以用感光板或数字化图像探测器如CCD、CMOS进行记录，还可以在计算机上进行显示和分析处理。

亮场显微镜

  • 使用白光从样品下方照射，在样品上方观察透射光即可

  • 图像对比度取决于样品不同部位对光的吸收

  • 设备简单，样品也无需进行繁琐的处理

  • 对无色透明样品，例如未经任何处理的活细胞，由于缺乏足够的对比度而无法直接观察和成像（样品的内部结构并不会导致照明光强的吸收，从而不能形成有效的图像衬度）
  • 光学衍射极限限制了该技术的最高分辨率约为200nm
  • 离焦信息的干扰导致分辨率也较低

暗场显微镜

  • 改变照明方式，仅收集样品的散射光，提高图像对比度
  • 通过暗场光栅，将光挡在样品下方，从而使光从侧面到达，借助丁达尔效应

  • 需要采用准直光源使进入像平面的透射光（未散射的部分）强度降到最低。

  • 光强较弱导致成像时间过长。

光学显微术对无色透明样品无法直接成像的原因在于样品不改变照明光的强度分布

但实际上这些样品由于厚度和折射率的差异会改变照明光场的相位分布，只是由于人眼和探测器仅对强度敏感，不能直接记录相位信息。

因此，把照明光场经过样品后的相位改变量的分布转化成光强分布，即能够实现对这种样品的成像

相差显微镜

  • 将相位差转化为振幅变化
  • 将直射光的相位改变±90°并适当衰减，使直射光和衍射光发生干涉而使像平面上的复振幅分布近似正比于物体的相位分布
  • 圆环型聚光器：产生锥形照明光，获取倾斜光；在聚光镜内

  • 相位环：圆环型聚光器产生的倾斜光被聚焦，进行相移和衰减；位于物镜后焦平面处

  • 不适合厚样品（上述近似关系不成立）
  • 不适合极微小样品（光晕现象严重）

微分干涉差显微镜

  • 将相位差转化为振幅变化，使用偏振光，采用两个特殊棱镜（渥拉斯顿棱镜）完成
  • 两个偏振器：一个位于聚光器前（起偏器），另一个位于物镜后（检偏器）
  • 第一个棱镜：将偏振光将其分成两束，一束光穿过样品，另一束光穿过周围区域；在聚光镜内

  • 第二个棱镜：使经过样品后的两束光重新合并成一束并在像面发生干涉；位于物镜后焦平面处

  • 在样品中折射率发生突变的地方，两束光干涉的结果会使图像产生“浮雕”的立体效果

  • 实现起来要相对复杂一些，也更昂贵一些

高光谱显微镜

将高光谱成像技术和显微镜技术结合，通过对生物样本进行光谱成像，以获取检测样本的显微图像信息及反映其透射率的光谱信息

高光谱数据采集策略

点扫描光谱法(point-scanning spectrometry)

  • 利用成像系统(detectors arrays)中线形阵列，及时测量光谱信息，然后扫描所有空间位置(x, y)
  • 使用该策略的常见技术：高光谱共聚焦显微镜(hyperspectral confocal microscopy)

推扫式光谱法(pushbroom spectrometry)

  • 利用成像系统(detectors arrays)中2D阵列，每次收集一个(y, λ)切片，沿x维度扫描
  • 使用该策略的常见技术：高光谱线扫描显微镜(hyperspectral line-scanning microscopy)

波长扫描光谱法(wavelength-scanning spectrometry)

  • 每次收集一个(x, y)切片，沿λ维度扫描
  • 使用该策略的常见技术：基于数字光处理的成像光谱(digital-light-processing-based imaging spectrometry)、声光(acousto-optic)、基于液晶可调滤光片的成像光谱(liquid crystal tunable filter-based imaging spectroscopy)

快照成像光谱法(snapshot imaging spectrometry)

  • 一次曝光即可获取整个3D数据立方体
  • 与基于扫描的系统相比，可以显着提高光通量
  • 使用该策略的常见技术：图像映射光谱(image mapping spectrometry, IMS)、计算机断层扫描成像光谱(computed tomography imaging spectrometry, CTIS)、编码孔径快照光谱成像(coded aperture snapshot spectral imaging, CASSI)

参考链接

显微镜：

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高光谱显微镜：

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